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本帖最后由 Lisan-黎伞 于 2023-1-2 19:57 编辑#1
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三份南海岛碘珊瑚砂样品中可培养细菌多样性摘要：本研究采用多种基营养塔养基选择性分离南海岛德瑚砂中可培养的细菌，共态导纯培养细菌菌株349株，通过16SRNA基因序列分析，发现它们分别录属于4门（Actinoteria-ProteobacteriaFirmicutes和Bacteroidetes）、6纲、26目、43科、73届、134种，可培养细菌的优势类群为放线菌门，占所有分离菌株数量的60%；而且还发现18个16SrRNA基因序列相似性低于97%的潜在新种。本研究使用改良优化自营养培养基进行分离，较好地显示出样品中微生物的群落组成，且获得了大量溶在的稀有新物种资源。研究练表明，岛珊瑚砂样品的可塔养细菌资源十分丰富、细菌群落所涉及的生态功能完整、潜在新种比例较高，为吉期岛确微生物资源挖掘打下了良好的基础，也为后期微生物资源开发应用积累了丰宫且稀有的菌种资源。关键词：南海岛：募营养塔养基：可塔养细菌多样性：微生物资源Diversity of cultured bacteria isolated from three coral reef sediments in South China Sea
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引言：珊瑚礁是典型的生物礁，珊瑚礁生态系统是全球物种多样性最高、资源最丰富的生态系统之一，被誉为“海洋中的热带雨林”（龙丽娟 等, 2019）。岛礁生态系统中的微生物至关重要，它不仅参与珊瑚礁生态系统的化学循环和物质转化，还与珊瑚礁生态系统中各种生物的健康息息相关（周进 等,2014），但目前对岛礁环境微生物的研究相对较少，因此岛礁环境中微生物资源有待深入的研究。微生物在地球能量流动和物质循环中扮演了重要角色，也是珊瑚礁生态系统中重要成员，开展微生物多样性的研究将有助于了解微生物的在珊瑚礁生态系统中的功能，对珊瑚礁生态系统微生物资源的开发和利用有促进作用。近年来为了对于纯培养微生物多样性进行研究，许多学者通过改进培养基配方以及优化培养条件，显著提高了分离到的可培养微生物的多样性，并获得了更多新的微生物类群。孙创 等（2021）采用改良的2216E固体培养基、R2A固体培养基、MBM固体培养基、TCBS固体培养基和改良的2216E液体培养基对西太平洋海水中的微生物进行分离纯化，而且获得了多株新分类单元。Xian 等（2020）通过微生物网络分析，发现温单胞菌在群落中可以将复杂底物转化为绿弯菌等难培养微生物生长必须的小分子底物，于是利用菌株Tepidimonas SYSU G00190W 的上清液改良培养基，实现了热泉生境中未培养绿弯菌的定向分离培养，进一步代谢组学研究表明，培养基上清液中含有很多小分子有机基质，可作为未培养细菌生长的潜在营养物质。何媛秋等（2020）通过采用不同培养温度、盐度、pH、样品稀释倍数和营养浓度条件对南海沉积物样品进行可培养细菌的多样性研究，发现寡营养、20倍的样品稀释倍数、pH 6和0.05%以下的有机营养物浓度更有利于稀有细菌类群的分离培养。熊
盈盈 等（2021）总结前人对微生物分离培养的经验，提出针对未培养的环境微生物培养基和培养条件改良方法：添加抑制剂、样品抽提液或菌液，添加信号分子、电子供受体等物质，添加维生素、生物酶或蛋白因子，其他凝固剂代替琼脂，延长培养时间以及极限稀释培养法等。珊瑚礁样品采集难度较大，非常珍贵，为获得更多种类的可培养微生物，本研究采用五种不同营养成分的培养基，并添加不同的微量元素，对三个岛礁陆域珊瑚砂样品进行可培养微生物的分离；同
时分析了不同培养基条件下岛礁可培养细菌的多样性，岛礁可培养细菌的群落组成，以及使用PICRUSt2软件对不同岛礁微生物群落功能进行了合理预测，以展示其生态功能状况。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 珊瑚砂样品：
本次实验的南海岛礁珊瑚砂样品从有人岛礁永暑礁（Y11-砂）以及无人岛礁扁参礁（BS2-砂）和贝壳礁（BK-砂）采集获得，使用无菌采样勺取珊瑚砂表层 0~3 cm 的新鲜沉积砂样，装入无菌塑料保藏袋，放于-20℃保藏备用。
1.1.2 分离培养基：
实验采用 5 种寡营养培养基，包括 5%2216E 固体培养基，5%AIA（DifocM Actinomycete Isolation Agar）固体培养基，5%R2A 固体培养基，SN 固体培养基和 10%菌液琼脂培养基。同时分别单独添加微量元素（0.05%终浓度）包括醋酸钠、DMSP、半胱氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸等（表 1）。每种培养基中琼脂终浓度为 15. 0 g/L。
1.1.3 实验试剂与仪器：
细菌 16S rRNA 基因扩增的通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。5%Chelex⁃100 试剂：5 g Chelex 100 Resin（Bio-rad，USA）；100 mL 灭菌超纯水；Taq DNA 聚合酶（北京全式金）；PCR 仪（Eppendorf, German）；凝胶成像系统（Bio-rad, USA）；小型台式高速离心机和恒温箱（ESCO, Singapore）。
表 1 不同培养基的类型及其成分
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2 结果与分析
2.1 细菌多样性
通过菌株分离纯化，本研究共从 126 个未污染的分离平板获得 349 株细菌，经 16S rRNA 基因序列相似性比对分析，显示这些新分离的菌株分别与目前 134 个已知种亲缘关系相近，这些菌株均属于4 门，6 纲，26 目，43 科，73 属。4 个分离到的细菌门中放线菌门（Actinobacteria）的菌株占所有分离菌株的 60%，为优势菌门，其余依次为变形菌门（Proteobacteria, 28%）、厚壁菌门（Firmicutes, 11%）和拟杆菌门（Bacteroidetes, 2%）。分离到较多的属级类群为链霉菌属（Streptomyces，46 株）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora，40 株）和产微球茎菌属（Microbulbifer，37 株）。图 1 展示了纯培养菌株在不同分类等级中细菌类群所占的比例。图 2 展示了 134 个物种（选取同种菌株中相似度最高的作为代表菌株）与其最相似已知物种菌株的 16S rRNA 基因组列构建的系统发育关系。对获得的 4 个门级类群纯培养菌株的多样性分别进行描述。#6
3 讨论
珊瑚砂是以珊瑚碎屑为主并有石灰藻、有孔虫、棘皮动物碎片、贝壳碎片等组成的砂质沉积物，颗粒大小不等，规格多种多样，其最大的特点是表面微孔丰富，适宜大量的细菌生存。本研究采用纯培养方式对南海岛礁珊瑚砂环境可培养细菌多样性进行研究，共获得 349 株纯培养菌株。鉴定结果显示这些菌株分属于 4 门、6 纲、26 目、43 科、73 属、134 种，包括 56 个潜在的新种。其中放线菌门是最优势的细菌类群，占所有分离菌株的 60%，原因可能与三个样品营养贫瘠有关；其余依次为变形菌门（28%）、厚壁菌门（11%）和拟杆菌门（2%）。分离到较多的属级类群为链霉菌属（46 株）、糖多孢菌属（40 株）和产微球茎菌属（37 株）。分析发现样品 BK-S 和 BS2-S 的多样性较高，而 Y11 样品的多样性较为单一，其中样品 BK-S 和 BS2-S 来源于无人岛礁，Y11 样品来源的岛礁上有人类活动，对细菌群落功能的预测分析结果显示有人岛礁和无人岛礁细菌群体在其生态功能方面并无差异，这说明岛礁周边水下环境细菌生态功能并未因为岛礁陆域上人为活动而受到影响，因此 Y11 样品来源岛礁周围环境中的细菌多样性低的原因仍然未知。Sandra 等（2011）对红海亚喀巴湾东北部浅岸礁的碳酸盐砂和硅酸盐砂样品进行免培养细菌多样性的研究，发现珊瑚砂样品中细菌的群落组成主要为 γ-变形菌纲、放线菌纲、α-变形菌纲、δ-变形菌纲、厚壁菌门、拟杆菌门等。韩敏敏等（2020）使用 6 种普适性培养基对 Khai 岛和 Pathiu 岛采集的 2 份珊瑚礁沉积物样品进行分离培养，获得的可培养细菌类群为变形菌门(54.55%)、厚壁菌门(31.82%)、放线菌门(9.09%)和拟杆菌门(4.54%)。对比已有的对珊瑚砂细菌多样性的研究，本研究获得的可培养类群与珊瑚砂中主要细菌类群一致，并且通过优化改良培养基，从样品中获取了更多种类的菌株，有助于更好的反映珊瑚砂样品中可培养细菌的多样性。本研究将常用的 2216E、R2A、AIA 等基础培养基稀释到 5%，以及使用 SN、10%菌液琼脂等寡营养培养基对样品进行分离，从得到的纯培养菌株多样性来看，寡营养培养基珊瑚砂样品具有更好的分离效果。根据文献报道，在营养丰富的培养基中获得的微生物的数量并非最多，相反培养基中高浓度的营养物会影响寡营养微生物细胞生长，而用于培养寡营养环境中微生物的培养基中有机碳水平不应高于 50 mg/L（Jannasch et al, 1959;Kadota, 1981; Kjelleberg et al, 1985）。Cho 等（2004）在分析太平洋及远洋样品时，发现有 44 株 γ-变形菌无法在经典培养基上形成菌落，而其中 7 株菌却可以在 10%R2A琼脂培养基上形成菌落。Koch 等（2001）认为当寡营养微生物从营养贫乏的生态环境中突然转移到富营养环境中时，微生物无法快速适应环境变化，可能会在生长过程中产生有毒物质，例如有氧代谢形成的有毒产物累积或细胞内自由基过快积累，导致细胞损伤影响生长。同时，大量非代谢物质的转运摄取会导致细胞壁、细胞质生长不均衡，膜蛋白比例过高阻碍细胞质膜生长，细胞内代谢失调，影响细胞增殖机制。环境中有些微生物具有乙酰辅酶A连接酶（Acetate-CoA ligase, EC 6.2.1.1），能利用乙酸盐作为唯一碳源，使乙酸盐生成乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A是细胞生化代谢过程中重要的中间产物，可以转化成多种细胞所需要的营养物质。硫元素是生物体必需的营养元素，在海洋生态系统中硫酸盐、硫化物储存量巨大，不同价态硫化合物之间的转化主要由代谢功能多样的微生物等来完成，环境中的硫元素对某些微生物的生长至关重要。因此，本研究在寡营养培养基的基础上，添加乙酸钠、含硫氨基酸、DMSP等小分子物质来增加从环境中获取微生物的几率，从结果来看，与以往使用经典培养基进行环境样品分离相比，本研究获得的菌株在多样性和潜在新种数量等方面都有显著的提高。
南海热带岛礁环境和独特的珊瑚礁生态系统，造就了珊瑚砂中丰富的微生物多样性，同时微生物在适应环境过程中进化出多种多样的生理代谢途径以感应环境信号调节生理活性。因此，提高微生物细胞的可培养性不应局限于应用现有的一种或几种方法，而应该根据微生物的生态环境及生理状况设计更合理的培养策略，尝试多种培养方法，以更好地研究岛礁珊瑚砂的多样性，发掘稀有的具有应用价值的微生物资源。
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结论：目录功能大致正常，但是目录标题不能正常识别加粗，下划线，字体颜色等指令
另外，帖子的TID与PID不清楚在哪里查看，导致跳转指定帖子功能使用失败
另另外：如果同一帖子内目录功能嵌套使用是否会识别错误出现混乱，还等待进一步测试 没有2.2
单独一个 2.1还需要标注嘛？
论文格式忘的差不多了 九猜 发表于 2023-1-2 19:33
没有2.2
单独一个 2.1还需要标注嘛？
论文格式忘的差不多了
目的仅是测试目录功能，内容并不完全~
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